技術概述
定點突變（Site-directed mutagenesis，SDM）是指按照人們的意愿在體外對基因的特定編碼區(qū)和表達調控區(qū)定向發(fā)生缺失、插入或堿基替換等變異過程。體外定點突變的方法有寡核苷酸介導的定點突變、PCR介導的定點突變和盒式突變[1]。寡核苷酸定點突變指用含有突變堿基的寡聚核酸片段為引物，在聚合酶的作用下啟動DNA分子進行復制，合成新的有突變堿基序列的DNA新鏈。盒式突變又稱為片段取代法，是用一段人工合成具有突變序列的寡核苷酸片段，變性退火后產生粘性末端，取代野生型基因中相應序列[2]。PCR介導的定點突變主要采用重組PCR進行定點突變，首先通過引物設計在擴增片段的末端引入錯配堿基，再通過重疊延伸PCR（Splicing by overlap extension PCR，SOE PCR）將兩個末端相互重疊且都含有相同突變的片段進行拼接，將突變位點導入擴增片段的內部[3]。定點突變技術根據(jù)突變位點數(shù)目又分為單點突變和多重突變。
基因的定點突變主要應用于研究蛋白質結構和功能[4]；改造啟動子或DNA作用元件[4]；識別或改造酶的活性位點；提高蛋白的抗原性、穩(wěn)定性和晶體研究[5]；藥品的研發(fā)及基因治療[5]等。
技術詳情
定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。
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設計定點突變引物和擴增突變基因全長引物→準備模板DNA→PCR擴增突變位點及兩側序列→用酶消化PCR產物中的甲基化質?！厥諆啥薖CR片段→重組PCR→轉化→菌落PCR鑒定陽性克隆→測序分析。
定點突變引物設計；PCR反應；DpnI酶處理PCR產物。
（1）設計同一方向完全互補的定點突變引物，長度為 25-45?bp，一般都是以要突變的堿基為中心，各加上兩邊的長度至少為 10–15?bp的一段序列；突變引物GC含量應大于40%，Tm ≥78℃且引物的3’端以G或C結束。
（2）定點突變引物用高核苷酸液相色譜（FPLC）或聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進行純化。
（3）不使用普通的Taq酶進行擴增，因為會在PCR產物的3’端加A，會導致拼接片段產生移碼突變，為了防止產生新的突變，使用高保真DNA聚合酶（如Pfu聚合酶等）。
（4）用DpnI酶處理PCR產物中甲基化質粒模板，處理時間至少一個小時將甲基化質粒去除干凈。
（5）PCR產物進行切膠回收純化，回收的PCR產物等濃度混合，作為擴增定點突變全長的模板。
（6）GC含量高的復雜模板，可以加入2%-8%的DMSO提高反應效率。
Q1：轉化后平板上沒有菌落或菌落數(shù)少？
A1：感受態(tài)細胞轉化效率低，確保轉化效率在108?cfu/μg以上；DpnI酶消化的產物用乙醇沉淀純化，用少量的水溶解；轉化進入感受態(tài)細胞中的DpnI消化產物少，提高轉入感受態(tài)細胞PCR產物的量；抗生素濃度高，使用適當濃度的抗生素。
Q2：PCR產物凝膠電泳沒有條帶？
A2：檢查引物是否設計錯誤；選擇溫度梯度退火，尋找最適退火溫度；確保模板DNA的完整，提高PCR反應體系中模板的量或優(yōu)化PCR反應條件。
Q3：樣品誘變效率低？
A3：使DpnI酶消化PCR產物時間充足，延長消化處理時間，確保擴增中的原始模板被降解。
Q4：測序發(fā)現(xiàn)突變位點與設計不符？
A4：確定模板是否攜帶未知突變；引物設計不當，重新設計引物并提高退火溫度。
Q5：轉化后平板上的菌落多？
A5：DpnI酶消化PCR產物時間短，DpnI消化不完全，含有未突變的模板，應適當延長消化時間；抗生素失效，重新配置培養(yǎng)基并選擇適當濃度的抗生素。
Q6：PCR產物有雜帶無法確定目的條帶？
A6：優(yōu)化PCR反應條件，提高退火溫度，增加特異性；適當降低PCR反應延伸時間；適當減少模板的量。
PCR膠圖；測序結果等。
比較 | 寡核苷酸定點突變 | PCR介導的定點突變 | 盒式突變 |
優(yōu)點 | 保真度高 | 操作簡單、成功率高 | 簡單易行、突變效率高 |
缺點 | 操作復雜、周期長；在克隆待突變基因時會受到限制性酶切位點的限制 | DNA片段定點突變后續(xù)工作復雜，需要連到載體分子上才能對突變基因進行轉錄、翻譯等研究；質粒進行定點突變，不能確定質粒載體上有無突變。 | 需合成多條引物，成本高；靶DNA?序列的兩側需要有合適的酶切位點。 |
試劑：質粒提取試劑盒；基因定點突變試劑盒；膠回收試劑盒等。
儀器：PCR儀；離心機；紫外照膠儀；超凈工作臺等。
1. 張浩等. 定點突變技術的研究進展[J]. 免疫學雜志, 2000, 16: 108-110
2. 張寶中等. 用DREAM技術進行全長質?？焖俣ㄍ蛔僛J]. 生物工程學報, 2009, 25: 306-312
3. 李海濤等. 豬TLR5基因定點突變表達載體構建[J]. 東北農業(yè)大學學報, 2012, 43: 11-15
4. 戴燦等. 基于重疊延伸PCR法的定點突變技術[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2010, 10: 411-412
5. 嚴婉榮等. 3種基因突變方法在微生物中的應用研究進展[J]. 中國農學通報, 2012, 28: 179-184
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