技術(shù)概述
蛋白的酵母雙雜交實驗是以酵母的遺傳分析為基礎(chǔ)，研究蛋白間相互作用的一種有效技術(shù)手段。轉(zhuǎn)錄活化蛋白可以和DNA 上特異的序列結(jié)合而啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這種DNA 結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由其上兩個相互獨立的結(jié)構(gòu)域，即DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Binding Domain, BD)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(Activation Domain, AD)共同完成的。
以Gal4 系統(tǒng)為例，BD和AD 分別由Gal4 蛋白上不同的兩個結(jié)構(gòu)域(1-147aa 與768-881aa)構(gòu)成。在利用GAL4 系統(tǒng)篩選cDNA 文庫或研究蛋白間的相互作用時，DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶蛋白即”誘餌”相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結(jié)合。一般情況下，單獨的BD 可以與GAL4 上游活化序列（GAL UAS）結(jié)合但不能引起轉(zhuǎn)錄，單獨的AD 則不能與GAL UAS 結(jié)合；只有當(dāng)BD 與 AD 分別表達(dá)的融合蛋白由于相互作用而導(dǎo)致兩者在空間上相互靠近時，BD 與AD 才能與 GAL UAS結(jié)合并且引起報道基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活下游報告基因，通過這一系列實驗來驗證兩個蛋白之間的相互作用。
技術(shù)詳情
酵母雙雜交系統(tǒng)是一種基于真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制發(fā)展起來的蛋白質(zhì)相互作用檢測技術(shù)，由Fields和Song在1989年首次提出。該技術(shù)基于真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子（如GAL4）的結(jié)構(gòu)和功能特點。GAL4有兩個互不干擾的結(jié)構(gòu)域，兩個結(jié)構(gòu)域在分開時會行駛它們各自的功能，DNA結(jié)合域（DNA Binding Domain，BD）具有DNA的結(jié)合功能，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域（Activation Domain，AD）有激活轉(zhuǎn)錄的功能，將兩者連在一起會具有轉(zhuǎn)錄活性。將待研究的兩種蛋白分別與GAL4的BD和AD融合表達(dá)，能夠形成兩種融合蛋白。當(dāng)這兩種蛋白同時轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞后，能夠在酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用時，會促使BD與AD在空間上接近，進(jìn)而激活特定的報告基因，如LacZ、HIS3等，如果兩種蛋白沒有發(fā)生相互作用，報告基因就不會表達(dá)。通過檢測報告基因的是否表達(dá)，可以間接判斷兩種蛋白之間是否存在相互作用。
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膜系統(tǒng)
泛素（ubiquitin）分子量很小，由76aa殘基組成，作為信號分子參與到生物泛素化修飾過程，其連接另外一種蛋白質(zhì)的N端，然后被泛素專一性蛋白酶（UBPs）識別，從而導(dǎo)致與泛素相連的蛋白降解。泛素可以分成兩部分：N端（Nub），C端（Cub）。將泛素Nub的13位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼幔∟ubI突變?yōu)镹ubG），避免了Cub和Nub自我結(jié)合或接近。將Cub與LexA-VP16轉(zhuǎn)錄激活因子融合成一個融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常條件下NubG不與Cub結(jié)合，UBPs不能識別分離的泛素，轉(zhuǎn)錄激活因子不會被切下來。最后，將要檢測的兩種蛋白分別與NubG和Cub融合，。當(dāng)這兩種蛋白同時轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞后，能夠在酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用時，會促使NubG和Cub的相互接近，被UBPs識別，導(dǎo)致LexA-VP16的解離，進(jìn)入核內(nèi)，從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。
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典型的實驗步驟包括載體構(gòu)建（如pGADT7-AD和pGBKT7-BD）、酵母轉(zhuǎn)化以及在四缺培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選等。酵母雙雜交技術(shù)已被廣泛用于檢測弱相互作用、解析蛋白質(zhì)互作結(jié)構(gòu)域以及篩選新的互作蛋白，成為蛋白質(zhì)功能研究中的重要工具。
泛素（ubiquitin）分子量很小，由76aa殘基組成，作為信號分子參與到生物泛素化修飾過程，其連接另外一種蛋白質(zhì)的N端，然后被泛素專一性蛋白酶（UBPs）識別，從而導(dǎo)致與泛素相連的蛋白降解。泛素可以分成兩部分：N端（Nub），C端（Cub）。將泛素Nub的13位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼幔∟ubI突變?yōu)镹ubG），避免了Cub和Nub自我結(jié)合或接近。將Cub與LexA-VP16轉(zhuǎn)錄激活因子融合成一個融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常條件下NubG不與Cub結(jié)合，UBPs不能識別分離的泛素，轉(zhuǎn)錄激活因子不會被切下來。最后，將要檢測的兩種蛋白分別與NubG和Cub融合，。當(dāng)這兩種蛋白同時轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞后，能夠在酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用時，會促使NubG和Cub的相互接近，被UBPs識別，導(dǎo)致LexA-VP16的解離，進(jìn)入核內(nèi)，從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。
典型的實驗步驟包括載體構(gòu)建（如pGADT7-AD和pGBKT7-BD）、酵母轉(zhuǎn)化以及在四缺培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選等。酵母雙雜交技術(shù)已被廣泛用于檢測弱相互作用、解析蛋白質(zhì)互作結(jié)構(gòu)域以及篩選新的互作蛋白，成為蛋白質(zhì)功能研究中的重要工具。
酵母雙雜交系統(tǒng)的主要應(yīng)用，在于快速分析已知蛋白質(zhì)間的相互作用，以及篩選與已知蛋白互作的新配體及其編碼基因，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及藥物篩選等多個領(lǐng)域。該技術(shù)具備多項顯著優(yōu)勢：
（1）其相互作用信號依賴于細(xì)胞內(nèi)重建的轉(zhuǎn)錄因子活性，無需繁瑣的蛋白質(zhì)純化步驟。
（2）檢測過程在活細(xì)胞中進(jìn)行，更能反映真實的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。
（3）檢測結(jié)果基于報告基因產(chǎn)物的累積，因此能捕捉微弱或瞬時的相互作用，靈敏度高。
該系統(tǒng)可利用來自不同組織、細(xì)胞類型或分化時期的cDNA文庫，廣泛適用于胞漿、胞核及膜蛋白等多種蛋白的功能研究。
載體構(gòu)建—制備感受態(tài)—轉(zhuǎn)化—點板—互作觀察
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如果手上有比較大量的純度比較高的蛋白質(zhì)的話?？梢試L試用以下比較直接的方法：1. isothermal titration calorimetry （ITC），直接測定兩個蛋白互相作用的Kd值。2. AUC，也就是超速離心分析?？梢灾苯訙y定兩個蛋白相互作用與否。3.SAXS, 也就是X-ray小角散亂。不過技術(shù)難度比較大一些。4. 溶液NMR，這個應(yīng)該可以但不太了解。5. 結(jié)晶再解構(gòu)，這個不用解釋了。比較究極一點。6.cryo-EM，同上。比較究級的方法。7. 最簡單常用的，gel-filtration，觀察有沒有oligomer的分子量峰出現(xiàn)。但是相互作用弱的話很難觀測到。8.更簡單常用的nativePAGE，同上，相互作用弱則很難觀測到。9.用氨基架橋試劑共價連接，然后SDS-PAGE?？纯从袥]有oligomer的帶。暫時想到這些，跨度比較大。