技術(shù)概述
運(yùn)用成熟的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)準(zhǔn)確、快速地定量檢測(cè)各種組織、原代細(xì)胞及細(xì)胞系中目的miRNA的表達(dá)情況。
MicroRNA(miRNA) 是一類長(zhǎng)度約19-24nt的非編碼單鏈RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因的3′-UTR區(qū)部分或完全互補(bǔ)，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的作用。miRNA廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌及病毒的基因組中，調(diào)控生物體生長(zhǎng)發(fā)育和疾病發(fā)生等過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)。MiRNA的異常表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致生理狀態(tài)的異常和疾病的產(chǎn)生，在多種癌癥中，其表達(dá)水平會(huì)發(fā)生明顯改變，有可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。此外，在許多其他的病變組織和細(xì)胞中也檢測(cè)到了miRNA的異常表達(dá)。因此對(duì)miRNA的表達(dá)的研究具有重要意義。
miRNA的結(jié)構(gòu)較為特殊，其長(zhǎng)度只有19-24nt，不能夠?qū)ζ溆闷胀ㄒ镞M(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，一般可采取兩種特殊的miRNA逆轉(zhuǎn)錄方法：莖環(huán)法和加polyA尾法。在成功逆轉(zhuǎn)錄后，根據(jù)序列特點(diǎn)直接設(shè)計(jì)相應(yīng)的通用引物和特異性TaqMan探針，即可對(duì)其進(jìn)行熒光定量。除常規(guī)TaqMan探針以外，用戶還可選擇設(shè)計(jì)合成TaqMan-MGB探針，其探針設(shè)計(jì)得更短，特異性更高。
miRNA逆轉(zhuǎn)錄方法示意圖? A.莖環(huán)法B.加A法
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