技術(shù)概述
dsRNA（double-stranded RNA），雙鏈RNA在細胞內(nèi)誘導(dǎo)同源序列的基因表達受抑的現(xiàn)象稱為RNA干擾。
dsRNA 可以通過注射、電穿孔和化學(xué)試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等方式介入動物和細胞內(nèi)。dsRNA的制備是實施RNAi較為關(guān)鍵的一步。目前常用的dsRNA制備方法主要有2 種：體外轉(zhuǎn)錄法和體內(nèi)載體表達法。其中體外轉(zhuǎn)錄法合成dsRNA可以在預(yù)期的PCR產(chǎn)物兩端連上轉(zhuǎn)錄起始點(如T7、SP6等)，先用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄合成單鏈RNA, 再互補成dsRNA。
相比而言，要制備大量的dsRNA，采用體內(nèi)載體表達法即構(gòu)建質(zhì)粒，在細菌體內(nèi)表達更為經(jīng)濟高效。帶有發(fā)夾環(huán)的dsRNA包括2個反向互補的靶序列片段，中間插入一個單鏈環(huán)。通常構(gòu)建這樣的DNA模板，需要3步連接（3步克隆法）實現(xiàn)，這種方法操作較為繁瑣。
長鏈dsRNA設(shè)計合成流程：
1. 通過數(shù)據(jù)庫同源比對方法選取合適的目的基因序列
2. 目的基因序列的克隆
3. 向目的基因上加入接頭，可使用的接頭有T7，T3，SP6。
4. 體外反轉(zhuǎn)錄及雙鏈RNA退火。
5. 測定濃度。
技術(shù)詳情
參考文獻
[1]梁艷, Saksamerprome V , Sritunyalucksan K , et al. 一種大規(guī)模制備雙鏈RNA的簡單方法及其在斑節(jié)對蝦中的應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2010, 34(7):1011-1017.
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