技術概述
免疫沉淀（immunoprecipitation）是一種純化蛋白質的方法。將目標蛋白的抗體與細胞提取物一起孵育，使抗體與溶液中的蛋白質結合。然后利用蛋白 A/G 偶聯(lián)的瓊脂糖微珠從溶液中分離出抗體/抗原復合物，從而將目標蛋白質從復雜樣品中分離出來。最后通過 SDS-PAGE 即可分離出樣品用于蛋白質印跡分析。
抗體的選擇
多克隆抗體：多克隆抗體因其制備相對簡單，可與靶蛋白分子的多個位點結合，所形成的抗原抗體復合物較穩(wěn)定因而應用的最為廣泛。但多克隆抗體的缺點在于非特異性結合較多，常會導致反映本底升高和一定的假陽性結果。
單克隆抗體：與多克隆抗體相比，單克隆抗體往往只結合一種抗原表位，具有單一結合特異性，所以發(fā)生非特異結合的機會少，可被用于確定靶蛋白上某一部位的特殊結構，甚至可被用于區(qū)分相同靶蛋白的不同形式如構象變化和修飾。但反過來，單克隆抗體僅與單一表位結合的特性也會引起具有同一表位的不同靶蛋白間的交叉反應。??????
對免疫沉淀和免疫共沉淀而言，抗體與靶蛋白間的作用力最好是剛能達到分離的效果。結合力太弱，達不到分離的目的；反之，結合力太強，不利用后續(xù)的純化。因此，對單克隆抗體來說，其與靶蛋白的親合力就顯得尤為重要，通常，親合力小于10????? 7???? M??? －??? 1???? 的抗體就不適于免疫沉淀。
用于免疫沉淀及免疫共沉淀的理想抗體應是一組針對同一靶蛋白分子上不同表位的單克隆抗體的復合物。同時，為了保證分離效果，抗體常被事先固定在固相支持物如多聚糖凝膠顆粒Sepharose CL-4B上，或將抗體與無關的抗免疫球蛋白抗體以及能同免疫球蛋白結合的蛋白A或蛋白G連接。
免疫沉淀方法
免疫沉淀的靶蛋白一般來自細胞裂解液，可以是被同位素標記的也可以是未被標記的。若為前者，免疫沉淀后再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，只需壓片即可檢測到靶蛋白的存在；若為后者，經(jīng)免疫沉淀和聚丙烯酰凝膠電泳后，尚需借助銀染或免疫印跡進行鑒定。
免疫沉淀反應
免疫沉淀蛋白質可采用幾種不同方法。
第一種方法（方法 A）是先將蛋白質樣品與抗體混合，然后加入蛋白質 A/G 支持。此方法可獲得高純度蛋白質；但是，抗體也會與目標蛋白質共洗脫，有時候會阻礙蛋白質印跡檢測。
第二種方法（方法 B）是將抗體與蛋白質 A/G 微珠結合，然后與抗原混合。此方法的產(chǎn)率比前者低，但可避免抗體共洗脫問題。
洗脫
將蛋白質從微珠中洗脫出來的方法有三種。SDS 緩沖液的洗脫性最強，還可將非共價結合抗體和抗體片段連同目標蛋白質一起洗脫。另一方面，甘氨酸緩沖液洗脫可輕度洗脫蛋白質和少量抗體。尿素緩沖液洗脫由于樣品可被蛋白水解酶消化，因此該方法對質譜測定具有一定優(yōu)勢。
技術詳情
聚生物技術詞條修善計劃
對現(xiàn)在的詞條不滿意？或者您有關于該技術的獨特見解，最新發(fā)展資訊？都可以投稿給聚生物。一經(jīng)采用，您對該詞條的貢獻將被聚生物所有用戶所看到。
投稿參加技術詞條修善計劃