技術(shù)概述
大腸桿菌是第一個用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清晰，培養(yǎng)操作簡單，轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，生長繁殖快，成本低廉，可快速大規(guī)模生產(chǎn)目的蛋白的優(yōu)點，而且其表達外源基因產(chǎn)物的水平遠遠高于其他基因表達系統(tǒng)，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌中蛋白量的30%，因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。但是也存在一些不足，比如目的蛋白常以包涵體形式表達，產(chǎn)物純化困難，且原核表達系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達產(chǎn)物的生物活性較低等，同時基因的表達過程是一個復(fù)雜的過程，涉及基因的轉(zhuǎn)錄，翻譯，翻譯后加工，細胞的代謝以及細胞內(nèi)基因與蛋白，蛋白魚蛋白之間的互作等。
一個完整的原核表達系統(tǒng)通常包括配套的表達載體和表達菌株。如果是特殊的誘導(dǎo)表達還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗?zāi)康膩砜紤]，比如表達量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達產(chǎn)物的純化方法等等。
技術(shù)詳情
大腸桿菌（Escherichia coli）表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛，也是最經(jīng)濟實惠的蛋白表達系統(tǒng)。E. coli具有遺傳背景清楚、細胞增殖快、表達量高、穩(wěn)定性好和抗污染能力強等特點，適用于多種屬蛋白的表達，尤其對小分子蛋白的生產(chǎn)具有極大的優(yōu)勢，但也存在一些問題，如易形成包涵體和含有內(nèi)毒素等。
（1）一站式全流程服務(wù)
提供從最前端的密碼子優(yōu)化、載體構(gòu)建，到中期的蛋白表達，再到后期的純化及內(nèi)毒素去除的完整服務(wù)鏈?？蛻糁恍杼峁┠繕?biāo)基因序列，即可獲得最終的高純度蛋白產(chǎn)品，無需在不同服務(wù)商間周轉(zhuǎn)，省時省力。
（2）深度定制化能力
根據(jù)客戶對蛋白純度、活性、內(nèi)毒素水平等的具體要求，靈活提供包括密碼子優(yōu)化策略、表達載體、純化標(biāo)簽、去內(nèi)毒素等在內(nèi)的附加服務(wù)，真正滿足客戶的個性化項目需求。
（3）豐富的專業(yè)經(jīng)驗
擁有大量大腸桿菌系統(tǒng)的可溶性表達、復(fù)性及純化項目經(jīng)驗，尤其擅長處理易形成包涵體、難溶解、易沉淀的“難表達”蛋白，能通過多種技術(shù)手段提高復(fù)雜蛋白的可溶性和得率，項目成功率高。
（4）強大的資源庫儲備
備有多種經(jīng)過工程改造的E. coli細胞株和表達載體，能夠為客戶的特定目標(biāo)蛋白快速匹配和優(yōu)化出最適合的表達方案，確保最佳效果。
（1）基因合成及密碼子優(yōu)化；
（2）提供目的蛋白的序列信息或質(zhì)粒；
（3）分析并調(diào)取基因信號肽，跨膜區(qū)；
（4）載體構(gòu)建：
? ? ? ? ? a.克隆至合適的表達載體；
? ? ? ? ? b.質(zhì)粒測序；
? ? ? ? ? c.質(zhì)粒制備；
（5）轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)；
（6）純化蛋白。
IPTG16℃低溫誘導(dǎo)
16℃低溫自誘導(dǎo)
16℃ 低溫 自誘導(dǎo) ??????????????IPTG 16℃ 低溫 誘導(dǎo)
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p：破菌沉淀；
pre：破菌上清；
after：上柱流出；
5%：5%咪唑洗脫洗雜蛋白
30%：30%咪唑洗脫蛋白
30-2%：30%咪唑第二次洗脫蛋白
100%：100%咪唑洗脫蛋白
100%-2：100%咪唑第二次洗脫蛋白
marker：M:200kd；140kd；105kd；70kd；55kd；40kd；28kd；20kd；13kd；8kd；
gst：gst洗脫蛋白
gst-2：gst第二次洗脫蛋白
marker：M:200kd；140kd；110kd；75kd；55kd；42kd；30kd；23kd；18kd；10kd。
（資料來源：金小峰）
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